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Os irmãos Mario e Luigi, de ascendência italiana, vivem em Brooklyn (Nova Iorque), onde trabalham como canalizadores. Certo dia, durante um serviço de reparação de uma conduta de água, são sugados por um tubo e transportados para o Reino Cogumelo, um universo paralelo governado pela Princesa Peach. Sem saber do paradeiro do irmão, Mario vai ter de aprender a sobreviver naquele lugar, adquirindo capacidades bizarras mas que serão grandes mais-valias para destruir os planos de Bowser, um verdadeiro vilão que tenciona dominar o mundo.
